水稻（Oryza sativa L.）是一种在人类生活中具有重要经济价值的作物，稻田杂草的侵扰是导致水稻产量和质量急剧下降的重要原因。野慈姑（Sagittaria trifolia L.）是一种在稻田中危害严重的典型杂草，防除该杂草的一种常见策略是使用除草剂进行化学防治，常见的除草剂为乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制剂类除草剂，其靶标ALS是一类负责植物支链氨基酸生物合成的关键酶。ALS抑制剂类除草剂（尤其是苄嘧磺隆）在防除野慈姑中发挥了重要作用，但由于长期的除草剂胁迫导致野慈姑抗性品种的出现。以往的研究证实抗性野慈姑已经在辽宁省主要水稻种植区爆发严重，较敏感种群相比抗性倍数高达90倍。
沈阳农业大学植物保护学院纪明山教授团队，一直致力于研究野慈姑抗药性的相关机制。之前的研究在抗性野慈姑ALS蛋白的Pro197，Asp376，和Trp574位点上共发现6种替换，证实野慈姑靶标基因的突变是其靶标抗性（TSR）的潜在机制。然而，关于野慈姑非靶标抗性（NTSR）的分子机制尚不清楚。NTSR是一个复杂的解毒系统，其中细胞色素P450（P450s）和谷胱甘肽s-转移酶（GSTs）介导的解毒代谢，以及活性氧清除发挥了突出的作用。围绕这一问题，近日，该团队在Plant Physiology and Biochemistry（中科院2区，2022年影响因子5.437）发表题为“Increase in glutathione S-transferase activity and antioxidant damage ability drive resistance to bensulfuron-methyl in Sagittaria trifolia”的研究论文，揭示了野慈姑谷胱甘肽S-转移酶活性和抗氧化损伤能力的增加是其对苄嘧磺隆主要的非靶标抗性机制。
1. GSTs活性的增加是野慈姑对苄嘧磺隆抗性发生的原因
研究发现，苄嘧磺隆与GST抑制剂（NBD-Cl）联用显著抑制了抗性植株（NHR）的生长，但其存活率仍显著高于敏感植株（NHS）。NHR的GST活性显著高于NHS，除草剂与GST抑制剂联用后消除了这一差异。另外，在GST抑制剂处理后观察到GSH（谷胱甘肽）含量略有升高。结果表明，GSTs活性的增加是NHR对苄嘧磺隆产生抗性的原因。除GSTs外，野慈姑的抗氧化能力可能也与抗性的发生有关。
Fig. 1. GSTs mediate the development of bensulfuron-methyl resistance in Sagittaria trifolia treated with bensulfuron-methyl. (A) Effects of P450 and GST inhibitor on S. trifolia resistance. (B) Dose-response curves of the NHS after bensulfuron-methyl treatment (●) and the NHR after bensulfuron-methyl treatment (○), bensulfuron-methyl + malathion treatment (▾), bensulfuron-methyl + NBD-Cl treatment (△). Each dot represents mean ± SD (standard derivation) of four replicates. (C) Alignment of CDS regions encoding ALS gene in the NHR and the NHS; consensus amino acid sequences are marked in blue. (D) Expression levels of StALS in the NHR and the NHS after bensulfuron-methyl treatment. Vertical bars indicate mean ± standard error.
Fig. 2. Changes in GSTs activity (A) and GSH content (B) in the NHS and NHR after bensulfuron-methyl treatment. Each dot represents mean ± SD (standard derivation) of three replicates. a, b, c indicate significant differences were observed at different days after bensulfuron-methyl treatment (P < 0.05).
2. 抗氧化能力的增加介导了野慈姑抗药性的发展
野慈姑NHR/NHS种群ROS清除相关物质的差异实验表明：NHS中氧化损伤指标过氧化氢（H2O2）与丙二醛（MDA）含量显著高于NHR，并且不受GST抑制剂处理的影响。在清除ROS的关键途径AsA-GSH循环中，抗坏血酸（AsA）与脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）是介导野慈姑抗苄嘧磺隆的关键因子。另外，GSH-GSSG循环也参与了ROS的清除，结果发现，GSH/GSSG（还原型谷胱甘肽）与谷胱甘肽还原酶（GR）在抗性野慈姑优越的抗氧化损伤能力中发挥重要作用。
Fig. 3. Changes in ROS scavengers in NHR and NHS populations of S. trifolia treated with bensulfuron-methyl. (A) H2O2 content; (B) MDA content; (C) AsA content; (D) APX activity; (E) DHAR activity; (F) GSH/GSSG ratio; (G) GR activity; (H) GPX activity; (I) GCL activity. Each dot represents mean ± SD (standard derivation) of three replicates. a, b, c indicated significant differences observed at the different days after bensulfuron-methyl treatment (P < 0.05).
Fig. 4. Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) and principal component analysis (PCA). OPLS-DA analysis of the NHR and the NHS (A); OPLS-DA analysis of the NHR (NBD-Cl) and the NHS (B); PCA analysis of the NHR and the NHS (C); PCA analysis of the NHR (NBD-Cl) and the NHS (D).
3.与解毒代谢和抗氧化损伤相关的关键基因表达
在整个实验过程中，NHR中StGST9的表达量均高于NHS，GST抑制剂显著抑制了该基因的表达。StGR1基因表达上调，并高于NHS，GST抑制剂处理不影响其表达。NHR中StDHAR1的表达量显著高于NHS，但随着时间的推移，转录水平逐渐下降，而GST抑制剂处理仅在2 DAT时抑制了其表达。
Fig. 5. Expression levels of key genes of NHR and NHS populations of S. trifolia treated with bensulfuron-methyl. StGST9 (A); StGCL2 (B); StGR1 (C); StDHAR1 (D); StAPX1 (E); StGPX3 (F). Each dot represents mean ± SD (standard derivation) of three replicates. a, b, c indicated significant differences observed at the different days after bensulfuron-methyl treatment (P < 0.05).
结论：GSTs介导的解毒代谢能力以及以GSH、AsA、GR和DHAR为关键因子的活性氧清除能力的提升是野慈姑对苄嘧磺隆产生抗性的重要原因。
作者基金：沈阳农业大学植物保护学院邹益泽为第一作者，曹诗函、孙中华和刘利茹做出重要贡献。河北省农林科学院粮油作物研究所赵铂锤博士参与了研究工作。沈阳农业大学植物保护学院纪明山教授为通讯作者。本研究得到了国家重点研发计划项目（2016YFD0200503-3）的资助。
